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    公开号:WO1988005468A1
    申请号:PCT/DE1988/000037
    申请日:1988-01-22
    公开日:1988-07-28
    发明作者:Uwe Klages；Alfred Weber；Ludwig Wilschowitz
    申请人:Schering Aktiengesellschaft Berlin Und Bergkamen；
    IPC主号:C12P13-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
    [0002] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L -Aminosäuren der allgemeinen Formel I
    [0003] (I)
    wann
    [0004] R1 einen gegebenenfalls durch Hydroxygruppen, Mercaptogruppen,Halogenatome, Aminogruppen, Carbonylgruppen oder Guanidino- gruppen substituierter und/oder durch Sauerstoffatome, Stickstoffatome oder Schwefelatome unterbrochener Alkylrest mit maximal 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, und im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel I auch deren Dithioverbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Mikroorganismus Nocardia spec. DSM 3306 oder Enzyme desselben auf ein D,L-Imida- zolidindion-Derivat der allgemeinen Formel II
    [0005] (II), .
    worin
    [0006] R1 die obengenannte Bedeutung besitzt oder im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel II auch auf deren Dithioverbindungen einwirken läßt.
    [0007] Die D,L-Imidazolidindion-Derivate der allgemeinen Formel II und demzufolge auch die daraus hergestellten L-Aminosäuren der allgemeinen Formel I können als Substituenten R1 beispielsweise die Methylgruppe, die Ethylgruppe, die Propylgruppe, die 1-Methylethylgruppe, die Butylgruppe, die 1- Methylpropylgruppe, die 2-Methylprαpylgruppe, die 1,1-Di- methylethylgruppe, die Pentylgruppe, die 1-Methylbutylgruppe, die 3-Methylbutylgruppe oder die Hexylgruppe tragen. Besonders bevorzugte Alkylgruppen R1 sind solche mit maximal 6 Kohlen- stoffatomen, wie die Methylgruppe des Verfahrensprodukts Alanin, die 1-Methylethylgruppe des Valins, die 2-Methyl- propylgruppe des Leucins, die 1-Methylpropylgruppe des Isoleuicins oder die Ethylgruppe der α-Aminobuttersäure.
    [0008] Die Alkylgruppen R1 können gegebenenfalls durch Hydroxygruppen, Mercaptogruppen, Halogenatome, Aminogruppen, Carbonylgruppen oder Guanidinogruppen substituiert sein, wobei einfach substituierte Alkylgruppen bevorzugt sind, oder durch Sauerstoffatome (vorzugsweise eins), Stickstoffatome (vorzugsweise eins oder zwei) oder Schwefelatome (vorzugsweise eins) unterbrochen sein. Als Alkylgruppen, die durch Hydroxygruppen oder Mercaptogruppen substituiert sind, seien besonders hervorgehoben die Hydroxymethylgruppe des Serins, die 1- Hydroxyethylgruppe des Threonins, die Mercaptomethylgruppe des Cysteins, die 2-Mercaptoethylgruppe des Homocysteins und die 1-Mercapto-1-methyl-ethylgruppe des ß-Thiovalins. Als eine durch ein Schwefelatom unterbrochene Alkylgruppe R1 sei die 2-Methylthioethylgruppe des Methionins hervorgehoben, Alkylgruppen R1, die als Substituenten R1 eine Aminogruppe αder eine Guanidinαgruppe tragen sind beispielsweise die 2-Aminoethylgruppe der α,γ-Diaminobuttersäure, die 3-Aminopropylgruppe des Ornithins, die 3-Guanidinopropylgruppe des Arginins und die 4-Aminobutylgruppe des Lysins. Als Oxoalkylgruppen R1 kommen vorzugsweise solche in Betracht, die zusätzlich noch durch eine Hydroxygruppe, Aminogruppe oder Guanidinogruppe substituiert und/oder durch ein Sauerstoffatom oder ein Stickstoffatom - genauer eine Iminogruppe - unterbrochen sind; derartige Gruppen sind beispielsweise die Acetoxymethylgruppe des O-Acetylserins, die 1-Acetoxyethylgruppe des O-Acetylthreonins, die Carboxymethylgruppe der Asparaginsäure, die 2-Carboxyethylgruppe der Glutaminsäure, die 2-Methoxy-2-oxoethylgruppe des ω -Asparaginsäuremonomethylesters, die 3-Ureidopropylgruppe des Citrulins oder die 3-Guanidino-3-oxo-propylgruppe des Canavanins.
    [0009] Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung des Mikroorganismus Nocardia spec. DSM 3306 durchgeführt. Dieser Mikroorganismus wurde aus Erdproben isoliert, indem man diese mit einem Mineralsalzmedium, welches 5-(2-Methylpropyl)-hydantoin als einzige Stickstoffquelle enthielt, versetzte, ineubierte und die gewachsenen Kulturen auf Agarplatten, die ebenfalls 5-(2-Methylpropyl)-hydantoin als einzige Stickstoffquelle enthielten, ausplattete.
    [0010] Der erhaltene Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen hinterlegt und erhielt dort die Nummer DSM 3306. Er steht der Fachwelt unwiderruflich zur Verfügung. Er besitzt taxonomisch folgende Eigenschaften:
    [0011] Koloniemorphologie rund, unregelmäßiger Rand, nicht durchscheinend,
    [0012] Zellmorphαlogie in jungen Kulturen Stäbchen 1,2 μm dick, 8-20 μm lang, fragmentieren zu Stäbchen von 2-5 μm Länge, unverzweigt, unbeweglich
    [0013] Gram-Färbung gram-positiv Säurefestigkeit negativ Endosporen negativ
    [0014] Sauerstoffverhältnis obligat aerob Katalase positiv Oxidase positiv
    [0015] Temperaturoptimum 30-37°C Citratverwertung negativ Nitrit aus Mitrat positiv Indolbildung negativ Methylrot negativ Voges-Proskauer negativ Urease negativ
    [0016] H2S-Bildung negativ Gelatineverflüssigung positiv Stärkehydrolyse positiv Zuckerverwertung Säure aus Saccharose, Glucose, Fructose,
    [0017] Arabinose, keine Gasbildung
    [0018] NaCl-Toleranz bis 5%.
    [0019] Aufgrund seiner morphologischen und physiologischen Eigenschaften wurde der Stamm nach "Bergey's Manual of Determi¬native Bacteriology", 8. Auflage (1974), vorläufig der Gattung Nocardia zugeordnet. Dieser Mikroorganismus wird unter den üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man der Kultur das Substrat (vorzugsweise in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.
    [0020] Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Wasser, Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd.
    [0021] Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art der verwendeten Fermentationsbedingungen abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Sterαidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Fermentationsbrühe vorzugsweise auf einen pH-Wert von 7,5-10 eingestellt.
    [0022] Andererseits ist es aber auch möglich, den angezüchteten Mikroorganismus beispielsweise durch Filtration oder Zentri- fugieren vom Kulturmedium abzutrennen, ihn gewünschtenfalls mittels einer der bekannten Methoden zu immobilisieren und die Fermentation der Substrate mit der isolierten Zellmasse im resting cell Verfahren oder mittels der Immobilisate durchzuführen.
    [0023] Die nachfolgenden Aus führungsbeispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens. B eis p ie l 1
    [0024] Ein 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml sterilem Nährmedium enthaltend 0,5 g Fleischextrakt, 0,5 g Peptαn, 0,5 g Hefeextrakt und 0,2 g Natriumchlorid wird mit Nocardia spec. DSM 3306 beimpft und 20 Stunden lang bei 30° C mit 180 Umdrehungen/Minute geschüttelt. Dann trennt man die Zellmasse durch Zentrifugieren ab und wäscht sie mit physiologischer Kochsalzlösung.
    [0025] 400 mg der feuchten Zellmasse werden in 10 ml 0,1 M Tris/HCl- Puffer vom pH 8,5 suspendiert, mit 10 mg 5-(2-Methylpropyl)- hydantoin versetzt und 24 Stunden lang bei 30° C incubiert. Durch Bestimmung mit L-Aminosäure-Oxidase wird ermittelt, daß 7,9 mg L-Leucin gebildet werden.
    [0026] Beispiel 2
    [0027] Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden aus 10 mg 5-(1-Methylpropyl)-hydantoin 3,5 mg L-Isoleucin gebildet.
    [0028] Beispiel 3
    [0029] Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden aus 10 mg 5-(1-Methylethyl)-hydantoin 2,5 mg L-Valin gebildet.
    [0030] Beispiel 4
    [0031] Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden aus 10 mg
    [0032] 5,5'-Dithiobismethylen-bis-hydantoin 2,1 mg Cystin gebildet.
    [0033] Beispiel 5
    [0034] Ein 2 1 Erlenmeyerkolben mit 500 ml sterilem Nährmedium enthaltend 2,5 g Fleischextrakt, 2,5 g Pepton, 2,5 g Hefe- extrakt und 1 g Natriumchlorid wird mit 50 ml einer 20 Stunden alten Kultur von Nocardia spec. DSM 3306 - hergestellt nach Beispiel 1 - beimpft und 20 Stunden lang bei 30° C mit 180 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Die Zellmasse wird abzentrifugiert und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.
    [0035] 8 g der feuchten Zellmasse werden in 200 ml 0,1 M Tris/HCl- Fuffer vom pH 8,5 suspendiert mit 1,0 g 5-( 2-Methylpropyl)- hydantoin versetzt und 24 Stunden lang bei 30° C incubiert. Man zentrifugiert die Zellmasse dann ab und isoliert aus dem Filtrat 660 mg L-Leucin vom Zersetzungspunkt 291° C (aus wäßrigem Ethanol) [α] = + 15,6° (20 όige wäßrige Salzsaure).
    [0036] Beispiel 6
    [0037] a) 3,5 g feuchte Zellmasse von Nocardia spec. DSM 3306 - hergestellt nach Beispiel 5 - werden in 31,5 g einer 2 %igen wässrigen Lösung von Natriumalginat suspendiert und in 500 ml einer 0,1 M wässerigen Lösung von Calziumchlorid-Dihydrat getropft.
    [0038] Er) 1,5 g des so erhaltenen Immobilisats werden in 10 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer vom pH 8,5 suspendiert mit 10 mg 5 (2-Methylpropyl)-hydantoin versetzt und 18 Stunden lang bei 30° C incubiert. Durch Bestimmung mit L-Aminosäure-Oxidase wird ermittelt, daß 7,8 mg L-Leucin gebildet werden. B eispiel 7
    [0039] Unter den Bedingungen des Beispiels 6 b werden aus 10 mg 5-(1-Methylpropyl)-hydantoin 3,2 mg L-Isoleucin gebildet.
    [0040] Beispiel 8
    [0041] Unter den Bedingungen des Beispiels 6 b werden aus 10 mg 5-(1-Methyl-ethyl)-hydantoin 2,1 mg L-Valin gebildet.
    [0042] Beispiel 9
    [0043] Unter den Bedingungen des Beispiels 6 b werden aus 10 mg 5,5'-Dithiobismethylen-bis-hydantoin 4,1 mg Cystin gebildet,
    权利要求:
    ClaimsPatentansprüche
    1. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren der allgemeinen Formel I
    (I), worin
    R1 einen gegebenenfalls durch Hydroxygruppen, Mercaptogruppen, Halogenatome, Aminogruppen, Carbonylgruppen oder Guanidinogruppen substituierter und/oder durch Sauerstoffatome, Stickstoffatome oder Schwefelatome unterbrochener Alkylrest mit maximal 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, und im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel I auch deren Dithioverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Nocardia spec. DSM 3306 oder Enzyme desselben auf ein D,L-Imidazolidindion-Derivat der allgemeinen Formel II
    (II), worin
    R1 die obengenannte Bedeutung besitzt oder im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel II auch auf deren Dithioverbindungen einwirken läßt.
    2. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren der allgemeinen Formel I a (Ia), worin
    R2 einen gegebenenfalls durch eine Hydroxygruppe, eine Mercaptogruppe, eine Methylthiogruppe, eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder Guanidinogruppe substituierter Alkylrest mit maximal 6 Kohlenstoffatomen bedeutet und im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel I a auch deren Dithioverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Nocardia spec. DSM 3306 oder Enzyme desselben auf ein D,L-Imidazolidindion-Derivat der allgemeinen Formel II a
    (Ha), worin
    R2 die obengenannte Bedeutung besitzt oder im Falle der Mercaptoverbindungen der Formel II auch auf deren Dithioverbindungen einwirken läßt.
    3. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren der allgemeinen Formel I b
    (Ib) worin:
    R3 eine Alkylgruppe mit maximal 6 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptomethylgruppe oder die Gruppierung der Formel III
    (III) b ed eu t e t , dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Nocardia spec. DSM 3306 oder Enzyme desselben auf ein D,L-Imida- zolidindion-Derivat der allgemeinen Formel II b
    (Hb)
    worin
    R4 eine Alkylgruppe mit maximal 6 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptomethylgruppe oder die Gruppierung der Formel IV
    (IV), bedeutet, einwirken läßt.
    类似技术:
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    法律状态:
    1988-07-23| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988901022 Country of ref document: EP |
    1988-07-28| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): FI JP US |
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    1989-01-18| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988901022 Country of ref document: EP |
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    优先权:
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